在顯色步驟中，選擇合適的DAB顯色時間是確保免疫組化（IHC）實驗結(jié)果準確性和可靠性的關(guān)鍵。DAB顯色時間不是固定的，需要根據(jù)實際情況進行調(diào)整，并且通常建議在顯微鏡下實時觀察以精確控制顯色時間。

1. 顯微鏡下的實時觀察

為了精確把握DAB顯色的終止時機，可以在顯色過程中定時使用顯微鏡觀察切片的染色效果。當(dāng)目標(biāo)蛋白位置出現(xiàn)清晰的棕色沉淀且對比度良好時，即可停止反應(yīng)。

2. 顯色時間的調(diào)整

顯色時間過短：可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白信號不夠明顯，導(dǎo)致染色不足。

顯色時間過長：可能導(dǎo)致DAB繼續(xù)沉淀，導(dǎo)致非特異性背景增加，使整個切片變得較暗。

3. 推薦的顯色時間范圍

一般情況：對于大多數(shù)組織切片，顯色時間控制在1至3分鐘之間是一個較為常見的范圍。

特殊情況：如果抗體濃度較高或組織類型特殊（如軟組織或硬組織），可能需要調(diào)整顯色時間。例如，軟組織如肝臟和肌肉，顯色時間較短，而硬組織如骨骼可能需要更長時間。

4. 梯度試驗

如果是第一次嘗試，可以進行梯度試驗，以確定最佳顯色時間。通過在不同時間點觀察顯色效果，可以找到最佳的顯色時間。

5. 注意事項

現(xiàn)配現(xiàn)用：DAB顯色液配置好了之后極容易產(chǎn)生DAB的沉積，從而導(dǎo)致樣本上會出現(xiàn)深棕色的絮狀沉淀，干擾結(jié)果的判定。

避免過時使用：DAB顯色液在配制完成后最長宜放置30分鐘以內(nèi)，過時不能使用。

終止反應(yīng)：顯色完成后，迅速將切片放入自來水中漂洗，終止反應(yīng)并固定染色效果。

通過以上方法，可以有效地選擇合適的DAB顯色時間，確保免疫組化實驗結(jié)果的準確性和可靠性。