構(gòu)建重組蛋白屢次失敗的原因：分為以下幾點

一、重組蛋白表達的原理

重組蛋白表達是利用DNA重組技術(shù)，將目標基因（外源基因）導(dǎo)入宿主細胞中，并通過宿主細胞的生物機制使其表達出特定蛋白。其主要步驟包括：

基因克?。簩⒛繕嘶蚪?jīng)過PCR擴增后，與表達載體連接，形成重組質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞中，可以使用化學(xué)方法、電穿孔或者嗜熱菌等方式進行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。

表達蛋白：重組質(zhì)粒進入宿主細胞后，融合到宿主細胞的染色體中，隨后遵循細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制，表達出目標蛋白。

二、常見的重組蛋白表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)：大腸桿菌是常用的重組蛋白表達宿主細胞之一。其優(yōu)點在于生長快速、易于培養(yǎng)，并且能夠產(chǎn)生大量的蛋白。此外，大腸桿菌的遺傳工具和代謝途徑也被廣泛研究，提供了便利。

酵母表達系統(tǒng)：酵母表達系統(tǒng)包括釀酒酵母和畢赤酵母。這些酵母細胞具有真核細胞的特點，能夠進行正確的蛋白折疊和修飾。同時，酵母細胞也可以進行大規(guī)模培養(yǎng)和高表達，適用于一些復(fù)雜蛋白的表達。

昆蟲細胞表達系統(tǒng)：昆蟲細胞表達系統(tǒng)常用于大規(guī)模蛋白表達。昆蟲細胞具有真核細胞的優(yōu)勢，能夠?qū)Φ鞍走M行正確的折疊和修飾，適合于表達大量需求復(fù)雜結(jié)構(gòu)的重組蛋白。

哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)可用于高效表達復(fù)雜蛋白和進行蛋白質(zhì)研究。哺乳動物細胞具有真核細胞特點，能夠進行正確的蛋白質(zhì)修飾和折疊，并且在一些特殊情況下需要考慮到人類蛋白的免疫原性。

三、重組蛋白生產(chǎn)步驟

細胞中有兩個蛋白生產(chǎn)階段：轉(zhuǎn)錄和翻譯，被稱為分子生物學(xué)的中心法則。換言之，轉(zhuǎn)錄和翻譯步驟屬于重組蛋白表達步驟。

為了生產(chǎn)重組蛋白，基因被分離并克隆到表達載體中。重組蛋白的生產(chǎn)需要蛋白表達系統(tǒng)、蛋白純化系統(tǒng)和蛋白識別系統(tǒng)。

獲取重組蛋白的基本步驟：

1.目標基因的擴增。

2.插入克隆載體。

3.亞克隆到表達載體中。

4.轉(zhuǎn)化到蛋白表達宿主中(細菌(大腸桿菌)、酵母細胞、哺乳動物細胞或桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng))。

5.重組蛋白鑒定試驗(Western blot或熒光)

6.大規(guī)模生產(chǎn)。(大規(guī)模發(fā)酵)

7.分離和純化。