全套操作約需1小時,分勻漿、細胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟,詳細說明如下。勻漿和細胞裂解:使用不同的實驗材料需采用不同的勻漿步驟,具體說明如下:【從動物組織中提取基因組DNA】使用研缽進行勻漿時:
① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的研缽中,快速用力展研成勻漿。注)下列組織請加液氮研磨至粉末狀。A.富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。B.富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。C.富含角質(zhì)蛋白的組織或堅硬的組織(如骨骼)等。
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1,溫和研磨30秒鐘。注)使用上述①-注)的實驗材料時,請在加入Solution A及RNase A1后,將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl,請補充Solution A至650 μl,65℃保溫5分鐘。
使用研磨棒進行勻漿時:
① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的Collection Tube 中,用研磨棒快速研磨成糊狀。
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。
③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中,充分振蕩混合后,65℃保溫5分鐘。
【從植物材料或植物培養(yǎng)細胞中提取基因組DNA】
① 按下表稱取適量的新鮮植物材料(如選用的是冷凍干燥植物材料,則用量減半),剪成小塊放入研缽中,加入液氮,待樣品冷凍后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應(yīng)間斷加入液氮以防止材料融化。植物材料種類植物材料使用量*植物花、葉片10~100 mg植物莖60~240 mg植物根80~240 mg植物種子80~240 mg* 如選取植物的根、種子等樣品時,因其基因組DNA含量很低,需使用超過表格中所示的參數(shù)用量,此時請分兩管進行步驟1~6的實驗操作,在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾,使各管的基因組DNA結(jié)合到同一個Spin Column上。如從培養(yǎng)的植物細胞中提取基因組DNA,請離心收集2×103~1×107的培養(yǎng)植物細胞,加入150 μl水充分懸浮細胞后移入研缽中,加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。注)樣品研磨應(yīng)充分,否則將會嚴重影響基因組DNA的收率。
② 將研缽移至65℃水浴,當(dāng)樣品粉末剛開始融化時,向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1,用力碾磨30秒。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中。如勻漿體積不足650 μl,請補充Solution A至650 μl。65℃保溫15分鐘。注)處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質(zhì)的種子等時,可延長水浴時間至60分鐘。
【從全血中提取基因組DNA】
① 取10~250 μl的全血(含抗凝劑)加入至Collection Tube中。
② 加入500 μl的Solution A。
③ 加入1 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘后,冰浴5分鐘。注) 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl;禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl。
【從培養(yǎng)細胞中提取基因組DNA】三.使用懸浮培養(yǎng)的動物細胞時:
① 使用Collection Tube收集1×105~1.5×107的細胞懸浮液,5,000 rpm離心5分鐘,棄上清(細胞培養(yǎng)液)。
② 加入150 μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細胞。
③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘,然后室溫靜置1分鐘。
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